В-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз является одним из наиболее распространенных лейкозов у взрослых. Заболевание характеризуется накоплением моноклональных CD5+ В-лимфоцитов, находящихся в фазах G0/G1 клеточного цикла. Первичное патогенное событие, вызывающее образование лейкозных В-клеток, до сих пор не определено, но достоверно известно, что нарушение апоптоза приводит к увеличению выживаемости циркулирующих клеток ХЛЛ в организме.
В отличие от большинства других гематологических ЗНО, ХЛЛ имеет низкую долю растущих клеток. Наибольшим пролиферативным потенциалом обладает менее 1% клеток. Полупериод жизни нормальных В-лимфоцитов составляет всего 5…7 дней, в то время как патологические В-лимфоциты ХЛЛ могут существовать в течение нескольких месяцев. Исследования с помощью нерадиоактивных изотопов, которые в организме человека могут включаться в структуру ДНК вновь образующихся клеток показали, что у разных пациентов от 1 до 10 % патологических В-лимфоцитов заменяются каждую неделю. Это свидетельствует о довольно активных процессах как пролиферации, так и спонтанного апоптоза, несмотря на нарушения в его системе.
Апоптоз
Апоптоз представляет собой особую, генетически запрограммированную, форму гибели клетки и является необходимым условием нормального существования любого организма. Назначение апоптоза состоит в поддержании постоянства численности клеток, обеспечении правильного соотношения клеток различных типов и в удалении дефектных или поврежденных клеток.
Процесс апоптоза клетки можно условно разделить на три фазы: сигнальную (индукторную), эффекторную и деградационную. Инициация апоптоза может происходить посредством внешних (внеклеточных) или внутриклеточных факторов. Например, в результате гипоксии, гипероксии, субнекротического поражения химическими или физическими агентами, перекрёстного связывания соответствующих рецепторов, нарушения сигналов клеточного цикла, удаления факторов роста и метаболизма и т.д. Несмотря на разнообразие инициирующих факторов, выделяются два основных пути передачи сигнала апоптоза: рецептор-зависимый (внешний) сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки и митохондриальный (внутренний) путь.
Внутренний путь апоптоза обычно запускается стрессом или ХТ-агентами и регулируется балансом про- и антиапоптотических белков Bax и Bak семейства Bcl-2. Внешний или рецептор-зависимый путь апоптоза индуцируется белками семейства фактора некроза опухоли (TNF).
На протяжении десятилетий ХТ считалась единственным методом лечения пациентов с прогрессирующим течением ХЛЛ. Неспецифические цитотоксические препараты, такие как алкилирующие агенты или аналоги пурина, обычно используются для индукции апоптоза по внутреннему пути. Однако использование химиотерапии при ХЛЛ ограничено из-за быстро развивающейся резистентности и частичной изначальной резистентности у пациентов с аномалиями TP53. Поэтому применение новых, высокоселективных (таргетных) и менее токсичных препаратов приобретает все большее значение в лечении ХЛЛ.
Окислительный стресс
Активные формы кислорода (АФК) – совокупность короткоживущих, реакционноспособных форм О2, возникающих в результате его электронного возбуждения или окислительно-восстановительных превращений. АФК постоянно генерируются в электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) митохондрий, образуются в содержащих редокс-системы мембранах и разных компартментах клетки как побочный продукт метаболических путей. Различные неблагоприятные факторы внешней и внутренней среды, воздействуя на жизнедеятельность клетки, индуцируют окислительный стресс – состояние, при котором генерация АФК превышает их образование в нормальном метаболизме.
Взаимодействие АФК с органическими молекулами и клеточными структурами приводит к повреждению липидов, белков, мембран и нуклеиновых кислот. АФК способны окислять дезоксирибозу, вызывать удаление отдельных нуклеотидов, неправильную сшивку цепи ДНК, являются мощными мутагенными агентами и приводят к ускоренному старению. Основным субстратом окисления в биологических мембранах являются полиненасыщенные жирные кислоты, входящие в состав липидов.
В ходе эволюции аэробные организмы создали антиоксидантную систему, обеспечивающую утилизацию АФК и защиту от их избытка. В широком понимании антиоксиданты – вещества, способные затормозить или полностью предотвратить окисление молекул органической и неорганической природы. Стратегия антиоксидантной защиты включает множество механизмов. К ним относят каталитическое удаление АФК с помощью ферментов (супероксиддисмутаза, каталаза и др.), предотвращение перевосстановления переносчиков в ЭТЦ с помощью разобщающих белков и /или вовлечения альтернативных путей транспорта электронов, а также белков, связывающих ионы металлов (трансферрины, альбумин, металлотионины и др.).
В патогенезе ХЛЛ имеют значение: повреждение ДНК, изменения генома, процессинга РНК и рибосом, клеточного цикла и регулируемой клеточной гибели, внутриклеточных сигнальных путей, включая BCR, Bcl-2, NOTCH1, NF-κB и др. Начальные онкогенные события происходят уже на уровне гемопоэтических стволовых клеток человека, которые в ходе многоступенчатого канцерогенеза дают начало клону клеток ХЛЛ.
Одним из факторов, вызывающим активацию внутриклеточных сигнальных путей выживания при ХЛЛ, как и при других лейкозах, является окислительный стресс – изменение клеточной среды
под влиянием патологических факторов вследствие дисбаланса между системами генерации активных форм кислорода (АФК) и азота и системами антиоксидантной защиты. Последние исследования показали, что изменения редокс-статуса могут участвовать в возникновении ХЛЛ, способствовать его развитию, а также тесно связаны с лечением и прогнозом лимфолейкоза.
АФК и окислительный стресс совместно с фосфорилированием белков поддерживают злокачественный фенотип клеток при ХЛЛ. АФК включают кислородсодержащие радикалы, такие как супероксиданион, гидроксильный и гидропероксильный радикал, а также нерадикальные формы, такие как перекись водорода и синглетный кислород. Реактогенными являются и активные формы азота: оксид азота и пероксинитрит.
АФК, образующиеся в результате метаболизма и обычно считающиеся патогенными из-за их реактивности по отношению к белкам, липидам и ДНК, в настоящее время рассматриваются в качестве важнейших факторов клеточной сигнализации и метаболизма в физиологических и патологических условиях. АФК участвуют в выживании, пролиферации, гибели клеток, тем самым поддерживая внутриклеточный гомеостаз.
При окислительном стрессе происходит активация транскрипционных факторов, включая NF-κB, ядерный дыхательный фактор-1 (Nrf-1), Nrf-2 (фактор-2, связанный с эритроидным ядерным фактором), протеин-1 (AP-1), p53, гипоксия-индуцируемый фактор-1α (HIF-1α), γ-рецепторы, активируемые пролифераторами пероксисом (PPAR-γ), фосфатидилинозитол-3-киназу (PI3K), митоген-активированную протеинкиназу (MAPK), трансдуктор сигнала и активатора транскрипции-3 (STAT-3), STAT-5 и др.
Активация связанных с окислительным стрессом транскрипционных факторов может влиять на экспрессию более 500 различных генов, включая факторы роста, их сигнальные пути, воспалительные цитокины, хемокины, регуляторы клеточного цикла, противовоспалительные молекулы и т.д. Окислительный стресс является важным фактором регуляции гомеостаза гемопоэтических стволовых клеток.
Принято считать, что ГСК очень чувствительны к изменениям уровня АФК, поскольку их жизнедеятельность протекает в отличие от других клеток организма в закрытой среде с низким окислительным потенциалом. Концентрация АФК определяет их эффекты на ГСК: низкие уровни АФК поддерживают ГСК в фазе покоя за счет регуляции активности молекул адгезии в гемопоэтической микросреде; умеренные концентрации АФК активируют пролиферацию ГСК за счет регуляции активности компонентов клеточного цикла; высокие уровни АФК повреждают белки, нуклеопротеины, липиды, нарушают метаболический статус, ускоряют старение и индуцируют гибель ГСК.
Избыточная генерация АФК в опухолевых клетках лежит в основе опухолевой прогрессии, может повреждать структуру и нарушать функцию практически всех биомолекул. В связи с последним фактом, в опухолевых клетках повышено содержание антиоксидантных ферментов для защиты от повреждающего действия АФК. Роль окислительного стресса в канцерогенезе включает регуляцию сигнальных путей пролиферации и апоптоза и как следствие выживания и избыточного накопления опухолевых клеток; участие в индукции и поддержании хронического воспалительного процесса, воспалительной микросреды опухоли и локальной и системной иммунносупрессии; обеспечение межклеточной и внутриклеточной коммуникации продуктами окислительного стресса; повышение генетической нестабильности путем разрушения ДНК и гистонов и др. факторы.
При ХЛЛ зафиксирован окислительный стресс с системным избытком АФК, дисбалансом антиоксидантов и эффективности антиоксидантной защиты. Особенностями генерации АФК в клетках ХЛЛ является низкий уровень НАДФН-оксидазы 2 типа, в частности ее каталитической субъединицы gp91phox, а основными источниками АФК выступают митохондрии с высоким уровнем окислительного фосфорилирования.
Избыточное окислительное фосфорилирование в митохондриях в условиях метаболической перестройки с угнетением гликолиза (в отличие от большинства злокачественных клеток) рассматривается как важнейший процесс выживания и самообновления клеток ХЛЛ.
Изменение активности компонентов антиоксидантной защиты в клетках ХЛЛ происходит, как следствие активации транскрипционных факторов, включая Nrf-2, NF-κB, FOXO, Nrf2 – ключевой фактор транскрипции, состоящий из семи консервативных доменов, который в ответ на окислительный стресс вызывает экспрессию ряда белков, участвующих в антиоксидантной защите.
Nrf2-зависимый стресс-реактивный внутриклеточный путь сигнализации активирует в клетках ХЛЛ экспрессию генов HO-1, каталазы, ГПО и СОД, преобразует активность антиоксидантной защиты за счёт окислительного стресса и фосфорилирования. При ХЛЛ и многих других опухолях наблюдается гиперэкспрессия Nrf2, что является одним из механизмов устойчивости опухолевых клеток к окислительному стрессу и противоопухолевой терапии, а применение агентов, блокирующих Nrf2-зависимую сигнализацию, оказывает цитотоксическое действие. В частности, активация Nrf2 в ответ на генерацию АФК в митохондриях увеличивает синтез восстановленного глутатиона, гемоксигеназы-1 и биогенез митохондрий, поврежденных при окислительном стрессе, восстанавливая таким образом энергетический метаболизм.
NF-κB – плейотропный транскрипционный фактор, связанный с воспалением, иммунным ответом, ростом и выживанием клеток, апоптозом и канцерогенезом, в т.ч. повышающий экспрессию генов СОД-2, гемоксигеназы-1, тиоредоксин-1 и тиоредоксин-2. В опухолевых клетках ХЛЛ экспрессия и активность NF-κB всегда повышены, что обеспечивает их выживаемость и пролиферацию.
Полагают, что аномальная активация канонического и неканонического путей активации NF-κB с соответствующими транскрипционными факторами имеют значение в возникновении опухолей из В-клеток. При ХЛЛ повышение активности генов-мишеней NF-κB, обусловленных как канонической, так и не канонической активацией NF-κB, ассоциировано с длительностью жизни, пролиферацией, хемотаксисом и лекарственной устойчивостью клеток ХЛЛ.
Семейство белков FOXO включают четыре изоформы (FOXO1, FOXO3, FOXO4, FOXO6), участвующие в дифференцировке клеток, остановке клеточного цикла, старении и апоптозе, антиоксидантной защите. Результаты исследований в условиях in vitro и in vivo позволяют рассматривать FOXO как опухолевые супрессоры, в т.ч. при гемобластозах. При окислительном стрессе и невысокой концентрации АФК FOXO за счет посттрансляционных изменений (фосфорилирования) повышают экспрессию в клетках ферментов антиокислительной защиты.
Избыточное содержание АФК в клетке нарушает функцию FOXO и подавляет ее транскрипционную активность. Ацетилирование FOXO при окислительном стрессе по остаткам лизина, а также убиквитинирование ослабляет связывание FOXO с ДНК. Кроме этого, противоопухолевая активность FOXO реализуется за счет подавления лиганда контрольной точки гибели-1 (PD-L1) и активации NK-клеток. Активность белков семейства FOXO снижена при многих злокачественных опухолях, при ХЛЛ это особенно отмечено для FOXO3a, что существенно повышает выживаемость клеток ХЛЛ.
В настоящее время позиция повсеместного, в том числе при злокачественных опухолях, применения антиоксидантов утратила свое значение, более того бесконтрольное применение витаминов С и Е, β-каротина и селена, N-ацетилцистеина и др. может иметь даже пагубные последствия для организма! Полагают, что применение антиоксидантов ограничивает регуляторную роль АФК в клеточных процессах, зачастую поддерживая канцерогенез или предотвращая гибель опухолевых клеток.
В тоже время, в опухолевых клетках, как одно из проявлений аллостаза, наблюдается изменение редокс-статуса, обеспечивающее жизнедеятельность опухолевых клеток, их безудержный рост, пролиферацию, отмену апоптоза, устойчивость к противоопухолевой терапии и эндогенным факторам противоопухолевой защиты, эволюцию злокачественной опухоли в целом. В связи с этим, в настоящее время внимание сосредоточено на новых фармакологических агентах, способных вызвать накопление АФК в опухолевых клетках и истощение в них резервов системы антиоксидантной защиты.
При ХЛЛ возможно применение нескольких соединений, способных вызывать гибель опухолевых клеток, подавляя антиоксидантную защиту за счет избыточного накопления АФК, истощения антиоксидантных ферментов. В частности, эллаговая кислота, а также митохондриотропный агент акацетин, индуцирующий образование АФК, 2-метоксиэстрадиол и β-фенилэтилизотиоцианат, ингибирующие СОД и снижающие уровень восстановленного глутатиона соответственно. Представляют интерес при ХЛЛ производные оридонина, которые действуют как прооксиданты при активации НАДФН-хиноноксидоредуктазы-1.
Ингибитор тирозинкиназы Брутона (Ибрутиниб) в настоящее время используется при лечении ХЛЛ, вызывает выработку АФК механизмами, которые еще полностью не изучены, что приводит к ингибированию фосфатаз, включая регуляторы сигнализации B-клеточных рецепторов SHP-1 и SHIP1. Венетоклакс вызывает диссоциацию комплекса Nrf-2/Keap-1, убиквитинирование и протеасомную деградацию Nrf-2, что способствует срыву антиоксидантной защиты клеток ХЛЛ и других гемобластозов.
Заключение
Окислительный стресс является важным фактором регуляции гомеостаза гемопоэтических стволовых клеток, активации внутриклеточных сигнальных путей и при ХЛЛ выступает в роли нового ключевого механизма, поддерживающего выживание и пролиферацию опухолевых B-клеток. Анализ различных источников позволяет выявить новые данные о механизмах окислительного стресса, особенностях избыточной генерации АФК и дисбалансе факторов антиоксидантной защиты в клетках ХЛЛ в отличие от других опухолей: преимущественную активацию окислительного фосфорилирования в митохондриях, низкий уровень НАДФН-оксидазы 2 типа, повышение экспрессии гемоксигеназы-1, глутатионпероксидазы и ферментов рециркуляции глутатиона, супероксиддисмутазы-2, тиоредоксинов и снижение экспрессии каталазы.
Сведения об участии окислительного стресса в регуляции активности транскрипционных факторов при ХЛЛ являются предпосылкой проведения исследований для более точного определения роли окислительного стресса в патогенезе ХЛЛ. В связи с данными об изменении редокс-статуса разрабатываются фармакологические агенты, способные вызвать накопление АФК и истощать резервы антиоксидантной защиты в опухолевых клетках за счет деградации Nrf-2, активации НАДФН-хиноноксидоредуктазы-1, прямой индукции образования АФК и др. механизмов, что открывает новые возможности применения молекулярно-таргетных терапевтических подходов при ХЛЛ, основанных на регуляции редокс-статуса опухолевых клеток.
При подготовке этой статьи использованы материалы:
1. Reed JC. Mechanisms of apoptosis. Am J Pathol. 2000 Nov; 157(5):1415-30. doi: 10.1016/S0002-9440(10)64779-7. PMID: 11073801; PMCID: PMC1885741.
2. М.В. Осиков, Е.А. Коробкин, А.А. Федосов, А.В. Синеглазова. “Роль изменений редокс-статуса в патогенезе хронического лимфолейкоза”. Вестник Современной Клинической Медицины, 2023. doi: 10.20969/VSKM.2023.16(5).65-71.
3. Т.К. Головко, Е.В. Силина, Е.А. Лашманова, А.В. Козловская. “Активные формы кислорода и антиоксиданты в живых системах: интегрирующий обзор”. Теорeтическая и прикладная экология, 2022. doi: 10.25750/1995-4301-2022-1-017-026
4. Pagano MA, Frezzato F, Visentin A, Trentin L, Brunati AM. Protein Phosphorylation and Redox Status: An as Yet Elusive Dyad in Chronic Lymphocytic Leukemia. Cancers. 2022; 14(19):4881. https://doi.org/10.3390/cancers14194881